翻白草在降血糖方面具有良好的疗效，其中黄酮类成分已被证实可以通过减轻胰岛素抵抗和保护修复胰岛细胞多种机制治疗2型糖尿病。本实验将翻白草三萜类成分粗提物采用大孔吸附树脂分离纯化，并通过小鼠体内降血糖实验，得出翻白草三萜类成分有降血糖作用的结论。

［摘要］目的：研究翻白草中三萜类成分粗提物的纯化方法及其纯化物对四氧嘧啶溶液诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用。方法：翻白草三萜类成分粗提物采用大孔吸附树脂分离纯化，并通过小鼠体内降血糖实验，评价翻白草三萜类成分的降血糖效果。结果：纯化的后的齐敦果酸和总三萜的纯度分别为3.18%、55.16%；各给药组小鼠空腹血糖浓度显著下降（P＜0.01），高剂量组降血糖效果最显著。结论：优选的纯化方法简单可行，质量可控，翻白草三萜类成分有降血糖的作用。

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，目前已成为了继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。随着我国人民生活水平的不断提高，糖尿病的发病率也在逐年升高。其中以2型糖尿病最为常见，占糖尿病患者总数的95%以上。目前，临床上用于治疗糖尿病的药物主要为西药，这些药大多有降血糖作用强、起效快的特点，但价格昂贵且容易使患者产生依赖性，并易引起不良反应，不利于患者长期使用。而中药具有多途径、多靶点特性，对患者的身体不会造成太大的影响，且价格低廉，已有多项研究表明中药在治疗糖尿病、减轻糖尿病对机体的损害、延缓糖尿病并发症方面疗效显著。

翻白草（PotentilladiscolorBge.）为蔷薇科委陵菜属植物翻白草的干燥全草，为版《中国药典》收载的中药品种，其味甘、微苦，性平，归肝、胃、大肠经，具有清热解毒、止痢、止血的功效，用于湿热泻痢、痈肿疮毒、血热吐衄、便血、崩漏等。翻白草作为一种民间常用中药，使用历史悠久，在民间偏方中，翻白草常用于糖尿病的治疗并显示了良好疗效。近年来对翻白草调节血糖的作用多有研究，但其活性成分及作用机制还没有定论。YangJ等证明翻白草的主要化学成分黄酮类和三萜类，可以在体外抑制糖原磷酸化酶的活性，从而降低血糖值。目前有关翻白草中黄酮类成分的研究较多，孙琛等研究发现翻白草中黄酮可以显著降低高血糖模型小鼠的血糖值，改善小鼠对胰岛素的抵抗力。相比于翻白草中黄酮类成分的研究，尚无对其含量较高的三萜类化合物降糖作用的研究，故本研究选定三萜类化合物进行研究，为翻白草调节血糖作用机制的研究提供一定的物质基础。

观察翻白草三萜类成分的降血糖作用必须建立在对其提取纯化的基础上。本项目通过前期研究，确立了翻白草中三萜类成分的最优提取纯化工艺。以四氧嘧啶溶液建立小鼠糖尿病模型，观察翻白草中的三萜类化合物对糖尿病小鼠血糖的影响，以期为后续的作用机制、制剂成型等研究提供物质基础。

1材料

1.1动物与试剂翻白草购于济南建联中药店，经山东中医药大学魏凤琴教授鉴定为年版《中国药典》收载品种；健康雄性昆明小鼠，购于济南朋悦实验动物繁殖有限公司，动物合格证号为SCXK（鲁），体质量20～23g；四氧嘧啶、血糖试剂盒（Sigma公司）；齐敦果酸标准品、熊果酸标准品（中国食品药品检定研究院，批号分别为-、-，供含量测定用）；盐酸二甲双胍（北京京风制药有限公司，批号）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2仪器Agilent高效液相色谱仪；色谱柱：KromasilC18（5μm，4.6mm×mm）；十万分之一电子天平（梅特勒公司）；岛津UV-型紫外—可见分光光度计（日本岛津公司）；超声波处理器（上海必能信仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-18冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）

2方法与结果

2.1翻白草三萜类成分粗提物的制备称取g翻白草药材，加入18倍的75%乙醇分三次提取，第一次加入8倍量的75%乙醇，第二次和第三次分别加入5倍量的75%乙醇，分别收集提取液，合并提取液，滤过，滤液经减压旋转蒸发后，冷冻干燥成粉，备用。

2.2齐敦果酸的测定①对照品溶液的制备：精密称取齐敦果酸标准品7.8mg，置25mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为0.mg/mL的齐敦果酸标准品溶液。②色谱条件流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（90∶10），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为nm。③标准曲线的绘制：分别精密吸取标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，置于5mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，得系列浓度的齐敦果酸标准溶液。按照上述色谱条件进行测定，以各标准品浓度对其峰面积线性回归，绘制标准曲线，得回归方程A=1E+07C+，R=0.，线性范围0.～0.mg/mL。④精密度考察：吸取齐敦果酸标准品溶液（0.mg/mL），注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，连续测定5次，齐敦果酸峰面积的变异系数（RSD）为1.13%，表明仪器精密度良好。⑤稳定性考察：吸取同一样品溶液，按上述色谱条件进行测定，每隔2h测定一次，共测定5次，结果峰面积的变异系数（RSD）为1.56%，表明样品溶液在10h内稳定性良好。⑥加样回收率实验：取已测得含量的样品溶液5份，分别加人不同量的齐敦果酸对照品，按上述色谱条件测定齐敦果酸含量，测得其平均回收率为.%，RSD为1.08%。

2.3总三萜的测定①对照品溶液的制备：称取熊果酸标准品16.1mg，置于25mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得浓度为0.mg/mL的熊果酸标准品溶液。②标准曲线的绘制：分别精密吸取标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，置于10mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，制得不同浓度的标准品溶液。各取0.5mL于10mL的具塞刻度试管中，水浴蒸干。加入0.2mL新鲜配制的香草醛-冰乙酸和0.8mL的高氯酸，混匀，在60℃水浴反应15min，取出，用冰水冲洗到室温，加入5mL的冰乙酸。同法取0.5mL的无水乙醇于10mL的具塞刻度试管中，制得空白对照。于nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程A=0.C+0.，R=0.。线性范围0.～0.mg。③精密度考察：精密吸取熊果酸标准品溶液1mL，按标准曲线项下的方法测定吸光度，连续测定5次，结果吸光度的变异系数（RSD）为1.9%，表明仪器精密度良好。④稳定性考察：吸取同一样品溶液（洗脱液），按标准曲线项下的方法测定吸光度，每隔2h测定一次，共测定5次，结果吸光度的变异系数（RSD）为2.3%，表明样品溶液在10h内稳定性良好。⑤加样回收率实验：取已测得含量的样品溶液5份，分别加入不同量的熊果酸对照品，按标准曲线项下测定吸光度，计算总三萜的含量，测得其平均回收率为99.%，RSD为1.24%。

2.4翻白草三萜类成分的纯化运用静态吸附与解吸试验对树脂型号进行筛选，结果8种大孔吸附树脂中AB-8型树脂吸附和解吸的效果较好。故选择AB-8型大孔吸附树脂对翻白草提取物进行分离纯化，粗提物用适量的75%乙醇溶解，溶液离心处理10min（r/min），收集上清液，作为上样液。先通过单因素试验对洗脱剂浓度、洗脱流速、上样液浓度、上样量、洗脱剂用量进行考察，然后通过正交实验确定翻白草三萜类成分的纯化工艺：翻白草溶液浓度为mg/mL，上样量为3BV，以4BV的30%乙醇除杂，以7BV的85%乙醇进行洗脱，洗脱流速为3BV/h。齐敦果酸的纯度为3.18%，转移率为93.63%；总三萜的纯度为55.16%，转移率为89.26%。洗脱液减压旋转蒸发后，冷冻干燥成粉（1g粉末相当于47g生药），备用。

2.5糖尿病小鼠模型的建立、分组、给药健康昆明小鼠70只，适应性喂养3d后，称重并标记，随机选取10只作为空白对照组，其余禁食不禁水12h，腹腔注射剂量为mg/kg体质量的2%四氧嘧啶生理盐水诱导糖尿病。正常喂养3d后，禁食不禁水12h，称重并尾部取血测定小鼠的空腹血糖值。血糖浓度高于11.1mmol/L的作为造模成功的糖尿病小鼠。将造模成功的小鼠随机分为6组（空白组，模型组，二甲双胍组，翻白草高、中、低剂量组），每组10只。空白组和模型组用生理盐水灌胃，剂量为0.2mL/10g，二甲双胍组按mg/kg体质量给予灌胃，翻白草高、中、低剂量组分别按mg/kg、mg/kg、50mg/kg体质量给予灌胃。各组每天灌胃1次，连续21d，分别在7d、14d、21d测定小鼠的体质量和空腹血糖，记录实验结果。

与空白组比较，各组小鼠在注射四氧嘧啶生理盐水后，体质量显著下降（P＜0.01），符合糖尿病“三多一少”中体质量下降的症状。与模型组比较，在给药14d后，二甲双胍组和高剂量组体质量有明显升高（P＜0.05）。在注射四氧嘧啶生理盐水后，模型组小鼠的血糖显著升高（P＜0.01），且在后续的21d中持续稳定在高血糖的水平。在给药21d后，高、中、低剂量组与模型组比较，空腹血糖值显著下降（P＜0.01）。由此可见，翻白草三萜类化合物能够有效降低糖尿病小鼠的血糖值，其中高剂量组和中剂量组改善血糖的作用更明显。

3讨论

翻白草在降血糖方面具有良好的疗效，其中黄酮类成分已被证实可以通过减轻胰岛素抵抗和保护修复胰岛细胞多种机制治疗2型糖尿病。研究表明，翻白草中含有较多的糖尿病患者体内所缺乏的重要微量元素，此也可能使其发挥降糖的作用。有研究表明齐敦果酸和熊果酸具有较好的降血糖作用，并可以防治糖尿病的并发症。三萜类成分在翻白草中的含量较高，且对其是否具有降血糖的作用尚无研究。本实验从一定程度上验证了翻白草三萜类成分治疗糖尿病的作用，但其作用机制以及后续的制剂成型研究仍需进一步探究。翻白草水煎液对CCL4导致大鼠慢性肝损伤具有明显的保护作用，可在一定程度上延缓纤维化的发展进程。但其发挥作用的成分和作用机制还没有定论，且翻白草三萜类成分是否也具有对肝损伤的保护作用，这些都需要进一步的研究。

从给药后的第一周到第三周，给药组同模型组比较，小鼠的血糖显著降低。三个剂量组随着给药时间的增加，血糖下降率也随之增加，表明翻白草三萜类成分对于长期控制血糖更有益。本研究在评价翻白草三萜类成分对糖尿病小鼠降糖作用的基础上，还研究了对正常小鼠的影响。结果表明，药物对正常小鼠的饮食、体质量、血糖均无影响，这说明翻白草三萜类成分的降糖作用只针对于高血糖模型小鼠，而对正常小鼠无影响。

［基金项目］山东省中医药科技发展计划项目（编号：-）

［作者简介］曲远均（-），男，山东蓬莱人，主管药师，从事中药新制剂新技术的研究。E-mail：

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